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重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量

发布者:亚博7797科技    发布时间:2021-06-08     
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按操作手(shou)册进(jin)行(xing),具体步骤如下。


一、重组蛋白质的诱导表达


1.挑取(qu)转(zhuan)化(hua)有质粒(li)的单(dan)菌(jun)落,接种(zhong)于 3ml 选择性 LB 液体(ti)培养基(ji)中,37 oC,250rpm/min 振摇培养过夜。


2. 次(ci)日(ri)将培养过夜的菌(jun)(jun)液 500 μl 再(zai)接种于 10 ml(1:::20)选择性 LB 液体培养基中,37 oC,250 rpm/min 振摇(yao)培养至(zhi)光密度(du)(OD600=0.6)时,取 1 ml 样(yang)本作(zuo)为诱导(dao)前标本,10000g 离心 1 min 收集菌(jun)(jun)体沉淀(dian),-20 oC 冻存备用(yong)。


3. 加入 1 mol/L IPTG 于菌(jun)液中,使(shi) IPTG 终浓度为(wei) 1 mM,37 oC,250 rpm/min振摇(yao)培养 4~5 小时。取 1 ml 样本作为(wei)诱导(dao)后标本,同上法收(shou)集菌(jun)体(ti)沉淀,-20 oC 冻存(cun)备用。


4. 将诱导前(qian)后菌体沉淀(dian)用 20 ~ 40 μl PBS(pH= 8.0)重悬,加入等体积的 2×SDS上(shang)样缓(huan)冲(chong)液,煮沸加热 5 min,SDS 聚(ju)丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电(dian)泳分离 ,考马(ma)斯亮(liang)蓝染色(se) 3 小时后,脱色(se)观(guan)察结(jie)果。


5. 选取诱导成功的细菌(jun)克隆,扩大诱导规模(mo),收集菌(jun)体沉淀,于(yu)-20 oC 保 存 ,准(zhun)备做下一步分析及纯化。


二、重组蛋白质的分离纯化


重组蛋白质的可溶性鉴定

1.将按(an)上(shang)法诱导(dao)培养(yang)后(hou)收集的菌体重悬于(yu)裂解液 1 (Lysis buffer under nativeconditions )中,然后(hou)在-80 oC 低温冰箱中放置 10 min。


2. 冰中解冻。


3. 在冰浴上用超声破碎仪破菌 6 次,每次 10 sec,间歇 10 sec,电压 200-300 V。


4. 10000g,4oC,离心 20 min,取上清(为溶液 A), -20 oC 保存;另将沉淀用同样裂解液 1 溶解(为溶液 B),同样-20 oC 保存,供后继分析使用。


5. 将(jiang)上述 A、B 溶液和诱(you)导前后的(de)细(xi)菌进行 SDS-PAGE 电泳,考马斯(si)亮蓝染色,比较分析重(zhong)组蛋白(bai)质的(de)溶解性。如(ru)果诱(you)导表达的(de)蛋白(bai)质位于(yu) A 溶液中(zhong),则(ze)为可溶性蛋白(bai);如(ru)果是(shi)在 B 溶液中(zhong),则(ze)为非可溶蛋白(bai)。


重组蛋白质为非可溶性蛋白(变性条件下)的分离纯化

1.将菌体沉淀溶于适量裂解(jie)液 2(Lysis buffer under denaturing conditions )中,室(shi)温下搅拌和吹打沉淀,避免泡沫(mo)生成。


2. 10000g,4 oC,离心 30 min,收集上清液。


3. 将 Ni-NTA Agarose 充填柱子,并连接于 Pharmarcia 低压液相层析系统,用 5倍柱体积的裂解液 2 平衡 Ni-NTA Agarose,调节 A280 值至零线。


4.将适量上清液上样到 Ni-NTA Agarose 柱子中,并用 lysis buffer 冲洗至 A280值低于 0.01。


5. 分别用 5~10 倍柱体积的清洗液 1 和清洗液 2(Wash buffer 1 and 2)清洗柱子,直至 A280 值低于 0.01。


6. 用洗脱液(Elution buffer)洗脱重组蛋白质,在 A280 值监测下,收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。


三、重组蛋白质的复性、冻干和定量

纯化后(hou)的(de)蛋(dan)(dan)白用梯度降低的(de)尿素溶液缓慢(man)透(tou)析(xi)(xi),最终用 0.01×PBS 透(tou)析(xi)(xi),透(tou)析(xi)(xi)后(hou)的(de)蛋(dan)(dan)白质溶液经冻干成(cheng)粉状。以牛血(xue)清白蛋(dan)(dan)白(BSA)为标准,采(cai)用 BIO-RAD 公(gong)司蛋(dan)(dan)白质定量试(shi)剂(protein assay)比色测定蛋(dan)(dan)白质的(de)含(han)量。




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