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AAT Bioquest——Caspases酶系列1:底物及抑制剂

发布者:亚博7797科技    发布时间:2021-06-28     
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什么是胱天蛋白酶?

胱(guang)天蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)(Caspases)是(shi)含半胱(guang)氨酸(suan)的(de)天冬氨酸(suan)蛋(dan)(dan)白(bai)水(shui)解(jie)酶(mei),它们(men)是(shi)为细(xi)胞凋亡的(de)主要(yao)介(jie)质(zhi)。多种受(shou)体(ti),例如TNF-α 受(shou)体(ti),FasL受(shou)体(ti),TLR和(he)死亡受(shou)体(ti),以及Bcl-2和(he)凋亡抑制剂(IAP)蛋(dan)(dan)白(bai)家族参与(yu)(yu)并调节(jie)该caspase依(yi)赖性凋亡途(tu)径。一(yi)旦(dan)Caspase受(shou)到(dao)上(shang)游信(xin)号(hao)(外部或内在(zai))刺激(ji)被激(ji)活(huo),即会(hui)参与(yu)(yu)执行下游蛋(dan)(dan)白(bai)底物的(de)水(shui)解(jie)作用,并触发一(yi)系列事件(jian),导致细(xi)胞分解(jie),死亡,吞噬作用和(he)细(xi)胞碎片的(de)清除。

 

人Caspases酶

人的(de)Caspases家族基于序列(lie)相似性(xing)和(he)生物学功(gong)能等共(gong)性(xing)主要可分为三大(da)类:第一(yi)类由(you)具(ju)(ju)有长胱(guang)(guang)天(tian)蛋白(bai)酶(mei)募集结(jie)(jie)构(gou)域(yu)的(de)“炎症(zheng)”胱(guang)(guang)天(tian)蛋白(bai)酶(mei)组成(cheng),他们(men)对P4位(wei)(wei)上的(de)较(jiao)大(da)的(de)芳香(xiang)族或疏水性(xing)残基具(ju)(ju)有亲和(he)力。第二类由(you)具(ju)(ju)有短的(de)前体结(jie)(jie)构(gou)域(yu)的(de)“细胞凋亡(wang)效应(ying)”胱(guang)(guang)天(tian)蛋白(bai)酶(mei)组成(cheng),而第三类由(you)具(ju)(ju)有长的(de)前提结(jie)(jie)构(gou)域(yu)的(de)Pap位(wei)(wei)置具(ju)(ju)有亮氨酸(suan)或缬氨酸(suan)底物亲和(he)力的(de)“凋亡(wang)引(yin)发剂”胱(guang)(guang)天(tian)蛋白(bai)酶(mei)组成(cheng)(表(biao)1)。

 

表1.人胱天蛋白酶的功能分类

细胞死亡途径半胱天冬酶类型酵素物种
细胞凋亡启动器Caspases 2人与鼠
细胞凋亡启动器Caspases 8人与鼠
细胞凋亡启动器Caspases 9人与鼠
细胞凋亡启动器Caspases 10人的
细胞凋亡效应器Caspases 3人与鼠
细胞凋亡效应器Caspases 6人与鼠
细胞凋亡效应器Caspases 6人与鼠
细胞焦亡炎性的Caspases 1人与鼠
细胞焦亡炎性的Caspases 4人的
细胞焦亡炎性的Caspases 5人的

 

启动器Caspase和效应器Caspase

根(gen)据(ju)其(qi)在(zai)凋亡胱天(tian)蛋(dan)白(bai)酶(mei)途(tu)径中(zhong)的作用,胱天(tian)蛋(dan)白(bai)酶(mei)可分为两类:启(qi)动器(qi)(qi)和效应器(qi)(qi)Caspase酶(mei)。启(qi)动器(qi)(qi)和效应器(qi)(qi)Caspas酶(mei)都(dou)具(ju)有由小(xiao)亚基和大亚基组(zu)成的催(cui)化(hua)位点,Caspase酶(mei)的识(shi)别位

 


 

凋亡启(qi)动(dong)(dong)器(qi)Caspase酶(mei),例(li)如(ru)caspase-2,-8,-9和-10可以启(qi)动(dong)(dong)caspase激(ji)(ji)活(huo)级联反应。Caspase-8对(dui)于形成死亡诱(you)导信(xin)号(hao)复合物(DISC)是(shi)必不(bu)可少的(de)(de),并且(qie)在激(ji)(ji)活(huo)后,Caspase-8激(ji)(ji)活(huo)下游(you)效应子Caspase(例(li)如(ru)Caspase 3)并介导线粒体中细胞色素c的(de)(de)释放。Caspase-8已(yi)被(bei)证明对(dui)IETD肽序列具(ju)有相对(dui)较高的(de)(de)底物选(xuan)择性(xing)。凋亡效应胱天蛋白酶(mei)例(li)如(ru)Caspase-3,-6和-7虽然(ran)不(bu)负(fu)责启(qi)动(dong)(dong)级联途径,但是(shi)当被(bei)激(ji)(ji)活(huo)时,它(ta)们在级联的(de)(de)中间(jian)和后续步(bu)骤中起着不(bu)可或缺的(de)(de)作用。Caspase-3(CPP32 / apopain)是(shi)关键效应器(qi),因为它(ta)放大(da)了来自(zi)启(qi)动(dong)(dong)器(qi)Caspase的(de)(de)信(xin)号(hao),使用对(dui)Caspase-3有选(xuan)择性(xing)的(de)(de)DEVD肽序列对(dui)活(huo)化的(de)(de)Caspase-3进行检测,可以检测Caspase-3的(de)(de)活(huo)性(xing)。

 

 Caspase酶底物和抑制剂

Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成:Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同,一般由三个或四个氨基酸组成(表2)。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基(ji)(Ac)碳苯甲氧(yang)基(Z)基团修饰,以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点,释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用,其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

 

表2. Caspase底物及其序列

多肽氨基酸序列对应的Caspase的种类
IETDIle-Glu-Thr-AspCaspase 8,颗粒酶B
DEVDAsp-Glu-Val-AspCaspase 3、6、7、8或10
LEHDLeu-Glu-His-AspCaspase 9
VADVal-Ala-AspCaspase 1、2、3、6、8、9或10


Caspase的显色底物

Caspase的显(xian)色(se)底物是有Caspase识别序(xu)列及生色(se)基团组成,常见的生色(se)团有pNA(对硝基苯(ben)胺(an)或4-硝基苯(ben)胺(an)),可使用酶(mei)标(biao)仪(yi)或分(fen)光光度(du)计在405 nm处进(jin)行(xing)光密度(du)检测。

 

表3. Caspase的显色底物

底物Caspase吸收(nm)颜色规格货号
Ac-DEVD-pNA * CAS 189950-66-1 *半胱天冬酶3405 nm黄色5 mg13405
Z-DEVD-pNA半胱天冬酶3405 nm黄色5 mg13422
Z-IETD-pNA * CAS 219138-21-3 *半胱天冬酶8,颗粒酶B405 nm黄色5 mg13413

 

Caspase的荧光底物

Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团,例如7-氨基-4-甲基香豆素(AMC),7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC), Rhodamine 110(R110)或ProRed?620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物(例如AMC和AFC)更敏感,但由于两步裂解过程,其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定,而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

 

Caspase的荧光底物.jpg

图.从左到右,分别是AMC(7-氨基-4-甲基香豆素),AFC(7-氨基-4-三氟甲基香豆素),Rhodamine 110(R110)和ProRed?620的激发和发射光谱。

 

表4.荧光半胱天冬酶底物。

底物名称对应的CaspaseEx(nm)Em(nm)ε?Φ?规格货号
Ac-DEVD-AFC * CAS 201608-14-2 *半胱天冬酶3、7376482170000.535mg13401
Ac-DEVD-AMC * CAS 169332-61-0 *半胱天冬酶3、734144119000N / D5mg13402
Z-DEVD-AFC半胱天冬酶3、7376482170000.535mg13420
Z-DEVD-AMC * CAS 1135416-11-3 *半胱天冬酶3、734144119000N / D5mg13421
Z-DEVD-ProRed?620半胱天冬酶3、7532619N / DN / D1mg13433
(Z-DEVD)2 -R110 * CAS 223538-61-2 *半胱天冬酶3、750052280000N / D1mg13430
Z-DEVD-ProRed?620半胱天冬酶3、7532619N / DN / D1mg13433
Ac-IETD-AFC * CAS 211990-57-7 *半胱天冬酶8,颗粒酶B376482170000.535mg13410
交流电-IETD-AMC半胱天冬酶8,颗粒酶B34144119000N / D5mg13411
Z-IETD-AFC * CAS 219138-02-0 *半胱天冬酶8,颗粒酶B376482170000.535mg13425

 

注意

  1. ε=在其最大吸收波长处的摩(mo)尔消光系数(单位= cm -1-1)。

  2. Φ=水性缓冲液(pH 7.2)中的荧光(guang)量子(zi)产率

 

Caspase抑制剂

Caspase抑制(zhi)(zhi)(zhi)剂(ji)能(neng)(neng)与Caspase的(de)(de)(de)活性位(wei)点结合并形成(cheng)可(ke)(ke)逆(ni)(ni)或(huo)不可(ke)(ke)逆(ni)(ni)的(de)(de)(de)连接,通(tong)常,Caspase抑制(zhi)(zhi)(zhi)剂(ji)的(de)(de)(de)结构由Caspase识别序(xu)列,诸(zhu)如醛(quan)(-CHO)或(huo)氟甲基酮(-FMK)的(de)(de)(de)官能(neng)(neng)团(tuan)组成(cheng)。具(ju)有醛(quan)官能(neng)(neng)团(tuan)的(de)(de)(de)胱(guang)(guang)天(tian)蛋(dan)白酶抑制(zhi)(zhi)(zhi)剂(ji)是可(ke)(ke)逆(ni)(ni)的(de)(de)(de),而具(ju)有FMK的(de)(de)(de)抑制(zhi)(zhi)(zhi)剂(ji)是不可(ke)(ke)逆(ni)(ni)的(de)(de)(de)。半(ban)胱(guang)(guang)天(tian)冬酶底物和抑制(zhi)(zhi)(zhi)剂(ji)都具(ju)有较小的(de)(de)(de)细胞毒性作(zuo)用,因此,它们是研究(jiu)半(ban)胱(guang)(guang)天(tian)冬酶活性的(de)(de)(de)有用工(gong)具(ju)。

 

表5.可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

抑制剂Caspase的种类是否可逆Ex(nm)Em(nm)规格货号
Ac-DEVD-CHO * CAS 169332-60-9 *半胱天冬酶3、7可逆的----1mg13403
Ac-IETD-CHO * CAS 191338-86-0 *半胱天冬酶8可逆的----5mg13412
mFluor?450-VAD-FMK半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10不可逆的40644525 tests13475
mFluor?510-VAD-FMK半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10不可逆的41250525 tests13476
FITC-C6-DEVD-FMK半胱天冬酶3、7不可逆的4915161mg13406
FITC-C6-DEVD-FMK半胱天冬酶3、7不可逆的491516100ug13408
FITC-C6-LEHD-FMK半胱天冬酶9不可逆的4915161mg13407
FITC-C6-LEHD-FMK半胱天冬酶9不可逆的491516100ug13409
FAM-VAD-FMK半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10不可逆的49351725 tests13470
SRB-VAD-FMK [磺胺丁胺B-VAD-FMK]半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10不可逆的55957725 tests13472

 

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